Resumo

A utilização e o manejo adequado de uma assepsia distribuída corretamente em um processo alcoólico contribuem em grande escala para os resultados finais.

Quem de fato produz o etanol é a levedura, desta forma, ter no processo uma cepa de levedura eficiente e dar a elas as melhores condições possíveis é a melhor forma de se obter sucesso na fermentação.

A produção do etanol nas usinas sucroalcoleitras ocorre dentro de dornas que contém a mistura de melaço, caldo de cana e as leveduras responsáveis pela fermentação.

As leveduras utilizadas no processo de produção de etanol nas usinas são as mesmas espécies (Saccharomyces Cerevisiae) normalmente utilizadas na fabricação de vinho e cerveja. No o entanto, no processo de produção de etanol, a fermentação (processo bioquímico de transformação do açúcar em álcool) ocorre em temperaturas maiores e em ambientes menos assépticos do que o das bebidas, favorecendo o aparecimento de contaminações tanto por leveduras selvagens quanto por bactérias (que estão na natureza). (CUNHA, 2018).

O objetivo é estudar o comportamento e a resistência de bactérias em relação a agentes químicos (bactericidas) com ação antimicrobiana e concentração determinada pelo fabricante para que ocorra a inibição dos microrganismos. Os microrganismos utilizados para o estudo foram E. Coli ATCC 8739, S. aureus ATCC 6538, E.coli cepas coletas no campo, foram os microrganismos utilizados.

Dessa forma, uma levedura de qualidade para a produção de etanol para suportar e se manter durante todo processo fermentativo durante toda safra é preciso boas praticas e boa produtividade, aplicando os princípios de boas praticas no processo já no momento quando a matéria prima (cana) entra na indústria para ser processada, implantando o primeiro método de assepsia na cana, aparelhos e instrumentos, segundo fazendo adições de biocidas naturais ou bactericidas.

PALAVRA – CHAVE: Microrganismo, Assepsia, Bactericida e Boa pratica.

ABSTRACT

The use and proper management of a properly distributed asepsis in an alcoholic process contribute to a large extent to the final results.

Who actually produces ethanol is yeast, so having an efficient yeast strain in the process and giving them the best possible conditions is the best way to succeed in fermentation.

Ethanol production in sugarcane plants occurs within dornas containing the mixture of molasses, cane juice and the yeasts responsible for fermentation.

The yeasts used in the ethanol production process in the mills are the same species (Saccharomyces cerevisiae) normally used in the manufacture of wine and beer. However, in the ethanol production process, fermentation (the biochemical process of transformation of sugar into alcohol) occurs at higher temperatures and in less aseptic environments than beverages, favoring the appearance of contamination by both wild yeasts and bacteria (which are in nature). (CUNHA, 2018).

The objective is to study the behavior and resistance of bacteria in relation to chemical agents (bactericides) with antimicrobial action and concentration determined by the manufacturer for the occurrence of inhibition of microorganisms. The microorganisms used for the study were E. coli ATCC 8739, S. aureus ATCC 6538, E. coli strains collected in the field, were the microorganisms used.

Thus, a quality yeast for the production of ethanol to support and maintain throughout the fermentation process throughout the harvest requires good practices and good productivity, applying the principles of good practices in the process already in the moment when the raw material (sugarcane) enters the industry to be processed, implanting the first method of asepsis in the cane, appliances and instruments, secondly making additions of natural or bactericidal biocides.

KEYWORD: Microorganism, Asepsis, Bactericide and Good Practice.

Introdução

A agroindústria do etanol é um grande e considerável gerador econômico do país. Como toda a produção de álcool ocorre por via fermentativa, o processo fermentativo, que tem sido constantemente aprimorado.

As infecções bacterianas na fermentação podem causar danos ao processo, tais como: consumo de açúcar, formação de goma, floculação do fermento, inibição de queda da viabilidade das leveduras devido às toxinas e ácidos orgânicos excretados no meio e, por consequência, redução no rendimento e na produtividade da fermentação (ALCARDE; HORII; NOBREI, 2007).

As contaminações bacterianas também se proliferam devido ás condições operacionais da própria indústria como sistema de moagem tratamento térmico, pontos mortos de esmagamento da própria cana, sistema de circulação dos caldos nos tanques.

A assepsia desdo primeiro momento do processo da cana é fundamental, para que haja uma redução nos índices bacterianos no processo. Na busca de alternativas que sejam viáveis e eficientes economicamente, gera a utilização de uma substancia de baixo custo, como adição de hidróxido de sódio (NAOH) vem sendo uma medida preventiva satisfatória para uma assepsia dos equipamentos e aparelhos no processo.

Para assegurar uma fermentação alcoólica sem competição de microrganismos, é recomendado o uso de biocidas naturais ou bactericidas.

Os testes de sensibilidade podem ser realizados para por em prova a eficácia do produto aplicado nos caldos em tratamento para o combate de bactérias, sendo possível prever o estado fermentativo.

A fermentação alcoólica em si é obrigatoriamente composta por vários microrganismos que merecem cuidados especiais, e como existe uma variedade muito grande de microrganismos indesejáveis que pode causar infecção no mosto, é de extrema importância á identificação desses agentes para que se efetue com eficiência no seu controle. (JUNIOR; DAMAZO; SANTOS, 2010).

O termo desinfetante é comumente empregado para designar substâncias capazes de destruir

microrganismos patogênicos não esporulados em curto espaço de tempo, quando aplicado a objetos inanimados. Sanitizantes são desinfetantes que reduzem o número de microrganismos a níveis considerados seguros para a saúde pública, porém como a grande maioria dos produtos comercializados encontra-se rotulado como “desinfetante” qualquer germe patogênico que se mostrar resistente ao desinfetante na maior diluição recomendada pelo fabricante é motivo de reprovação.

Material e Métodos

Abordagem deste artigo é embasada nos dois métodos utilizados no processo fermentativo alcoólico, o primeiro baseia – se na medida preventiva de assepsia com adição de NaOH e o segundo método é embasado na medida preventiva de adição de bactericidas.

O trabalho foi realizado em quatro etapas principais: escolha e avaliação dos componentes químicos (bactericidas) ativos, preparo dos materiais, incubação dos microrganismos, análise e interpretação dos resultados.

Os controles de assepsia e a implantação de uma medida corretiva, que se baseia em teste de sensibilidade para melhor escolha dos bactericidas a serem aplicados.

As pesquisas foram realizadas durante toda safra de 2018 com o intuito de supervisionar as reações de bactericidas aplicados no processo, o acompanhamento desta pesquisa foi realizada em uma usina no interior do estado de São Paulo.

Para o enfoque central da discussão deste trabalho foi analisar a eficiência dos quatros bactericidas adquiridos pela própria empresa, pela sua grande utilização como agente combatente no processo de assepsia.

Em teste em laboratório utilizou – se uma concentração de 200 µl de todos os bactericidas em testes com as bactérias prescritas nas fichas técnicas do fabricante.

Preparo dos Bactericidas

Os bactericidas foram preparados de acordo com as especificações contidas nas fichas técnicas fornecidas pelos fabricantes. Porém, foram submetidos à adição de matéria orgânica. Para o teste com adição da matéria orgânica utilizou-se concentração de bactericidas de 200µl. Com matéria orgânica, foi utilizado o caldo mosto com pH de 5,8, adicionou – se 1 mL em cada tubo de bactericida antes do início dos testes.

Procedimentos Microbiológicos

O preparo das culturas para as analises microbiológicas teste e o teste de aos microrganismos foi realizado baseando – se na portaria nº101, de 17 de agosto de 1993 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1993).

O preparo para coloração de gram características diferenciais se referindo à estrutura da parede celular dos microrganismos baseando – se na portaria nº 578, de 8 de dezembro de 1998, instrução normativa nº62, de agosto de 2003 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.

O preparo para as analises microbiológicas em contagem padrão de microrganismos aeróbios estritos e facultativos viáveis mesófilos foram realizados baseando – se na portaria nº101, de 17 de agosto de 1993 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1993).

Microrganismos Utilizados

Os microrganismos utilizados para a experimentação foram bactérias gram-positivas e gram-negativas, provenientes de isolamentos em água, com uma linhagem considerada padrão. As linhagens utilizadas, bem como as características de cada espécie, estão descritas na Tabela 1. Sua escolha justifica com os testes realizados com as fichas técnicas de cada fabricando.

Contagem padrão de microrganismos aeróbios estritos e facultativos viáveis mesófilos.

Utilizou – se tubos graduados e esterilizados, tendo dois período de coleta, antes da assepsia e após a assepsia com NaOH.

Realizou – se o mesmo procedimento de coleta com adição de bactericidas.

Adicionou – se 25 mL de todas as amostras em frascos separadamente e identificado com todas as amostras, contendo 225 mL de água peptonada 1% em todos os frascos.

Procedeu – se a repicagem de todas as amostras em tubos com 9 mL contendo água peptonada 1% , obtendo as diluições devidas, (10⁰, 10¹, 10²,10³,10⁴,10⁵,10⁶,10⁷) e plaqueamento em duplicata em petrifilm (Aerobic Count Plate). As placas foram incubadas a 36 ºC por 48 horas. Após, realizou-se a enumeração das colônias, os resultados foram expressos em log UFC/mL.

Preparo da suspenção de bactéria(s)

Realizou – se um pool de cepas (E.coli ATCC8736, S. aureus ATCC6538 e E.coli isolada em água), a serem utilizadas no teste de eficiência, em tubos contendo 3 mL de caldo infuso de cérebro-coração BHI. Incubou – se 36 ± 2ºC por 18 a 24horas.

Teste de eficiência dos bactericidas frente aos microrganismos

A avaliação de eficácia antibacteriana com o método de diluição, com teste de suspensão. Tubos de ensaio contendo os bactericidas na concentração 200 ppm com matéria orgânica, receberam 0,1 mL dos (isolados bacterianos). Mantendo-se constante a temperatura ambiente, após os tempos de contato 15’, 20’ e 30 min, foi retirada uma alíquota, por meio de alça bacteriológica de platina com 10 µL e colocada em tubos de ensaio contendo 3 mL do meio de cultura caldo BHI e incubados por 96 horas a 36 ± 1ºC. Após esse período fez- se a leitura observando a presença de turvação, película ou precipitado que indicava o crescimento bacteriano nos tubos.

Medição delta pH.

Coletaram-se amostras de caldo (primário, misto) e filtrou-se, transferiu-se 50 ml para um béquer e ajustou se o pH para 5,5 (pH inicial, com NaOH (1N) ou H3PO4 (1N)).

Incubou-se a 37°C por 4 horas em banho-maria ou estufa.

Determinou o pH após incubação (pH final). Calculando delta PH = pH inicial – pH final

Resultados e Discussões

A denominação “germicida”, isto é, bactericida, virucida, fungicida, amebicida, somente pode ser aplicado a agentes capazes de destruir os microrganismos.

O fabricante deve especificar quais os germes sensíveis, conforme a tabela 2 as descrições dos componentes, funções e aplicações dos bactericidas de acordo com a legislação do Ministério da Agricultura Abastecimento e Reforma Agrária vigente.

Componente	Função	Aplicação
*Cloreto de alquil dimetil benzil amônio	*Umectantes, detergentes, emulsificantes, antisséptico, agente bacteriostático e bactericida para processos industriais de açúcar e álcool.	*Indústria de cosméticos: atua como germicida e antisséptico utilizado na fabricação de desengordurantes, Indústria veterinária: atua em dosagens apropriadas, na desinfecção de canis, aviculturas, etc.
*Quaternário de amônio	*É um biocida que age principalmente sobre as bactérias gram⁺e gram^– sua ação sobre os microrganismos contaminantes se da pelos seguintes mecanismo: inibição enzimática, desnaturação proteica, lesão da membrana citoplasmática e consequentemente vazamento dos constituintes celulares.	*Indústrias de alimentos e de bebidas atuam como antimicrobianos dado por sua baixa de toxicidade, sem o inconveniente de gerar residuais no produto final.
*Cloreto de Benzalcônio	*Produto seguro sob ponto de vista ecológico, não deixando nenhum resíduo químico indesejável após a sua ação, biodegradável, sendo completa e rapidamente decomposta, sua dosagem pode ser aumentada, conforme as necessidades operacionais, sem o inconveniente de gerar residuais no produto final.	* Utilizado nas mais variadas indústrias, sendo dentre elas, a cosmética e a farmacêutica, responsável por sua habilidade de agir em prol da inibição da proliferação de microrganismos.

Tabela 2: Classificações e características dos bactericidas, aplicados nos processos industriais de sucroalcooleiro e também em outros setores industriais que visam no monitoramento asséptico, combatendo a multiplicação indesejada de microrganismos em todo processo.

As análises de delta pH nos principais caldos, primário e misto, notou – se um uma taxa de multiplicação de bactérias indesejada. Como se pode notar no gráfico1 no primeiro semestre da safra á um aumento na taxa de multiplicação, implantando analises mais detalhadas para eficiência das amostras dos bactericidas aplicadas no processo.

Após vários resultados com números elevados de contaminação nos caldos, o check – list no monitoramento da assepsia na moenda redobrou – se. Adição da solução aquosa de NaOH apresentou uma remoção parcialmente a matéria orgânica nas parede dos tranques e peneiras, evitando a proliferação de microrganismos contaminantes, como toda assepsia primaria no processo, á adição de bactericidas é essencial para alavancar um caldo com baixo índice de infecção bacteriana e diminuição de produção de ácidos, levando uma diminuição na taxa de multiplicação nos caldos.

Conforme as analises realizadas nos caldos com adição dos bactericidas, promoveu um declínio satisfatório no grau de infecção bacteriana nos caldos, com parâmetros satisfatório as analises de confirmação, foram necessária para dar mais ênfase na necessidade de um bom produto e uma assepsia bem dotada no processo industrial.

Figura2: Teste de eficiência dos bactericidas em contato com as bactérias aplicadas. A determinação para o teste teve o tempos testes em 15’, 20’ e 30 minutos de acordo com todos os testes dos bactericidas apenas a amostra três apresentou sensibilidade com as bactérias testadas, amostra três teve duas amostras teste uma no armazenamento em bário e a outra em armazenamento em contêiner, porém a unida amostra que teve sensibilidade em contato com as bactérias teste foi à amostra do bário, sendo sensível nos três tempos determinados.

Conclusão

Os Resultados obtidos nas condições em que o presente estudo foi realizado oferecem as seguintes conclusões.

A técnica de cultivo de microrganismo em suspensão em meio de cultura caldo infusão cérebro e coração permitiu uma visualização positiva dos microrganismos, mostrando viável para realização dos testes de eficiência dos bactericidas em foco.

Os quatros bactericidas analisados apresentaram atividade com os microrganismos satisfatoriamente e adequada.

O desemprenho dos bactericidas, Cloreto de alquil dimetil benzil amônio, Quaternário de amônio e Cloreto de benzalcônio em (contêiner) tiveram um desempenho positivo e satisfatório.

O desempenho da amostra do mesmo bactericida Cloreto de Benzalcônio, porém em armazenamento diferente em (Bário) não teve uma eficiência esperada em teste, foram insatisfaria e sensível nos tempos determinado.

Concluiu – se que todos os testes e analises realizada nas amostras é aliada a implantação do método de assepsia adequada, promovendo uma redução nos índices de contaminação bacterianos nos pontos de infecção do processo. E com a importância, no que diz respeito á eficiência no controle preventivo e pro- ativo de infecção no processo da produção de etanol.

Referência Bibliográfica

JUNIOR, D,A.S;DAMAZO,F,A.F;SANTOS,J.C.Controle e combate de microorganismos indesejáveis no processo de fermentação etanólica. 2010.06 f. Arq.Cienc e tecnologia – Centro Universitário de Lins – Unilins – 2010.

ALCARDE, A.R.; HORII, J.; NOBREI, T.P. Viabilidade celular de Saccharomyces

cerevisiae cultivada em associação com bactérias contaminantes da fermentação alcoólica.Ciência e Tecnologia dos Alimentos, Campinas, v. 27, n.1, p. 20-25, jan./mar. 2007.

CAETANO, A,C,G.;MADALENO,L,L.Controle de contaminantes bacterianos na fermentação alcoólica com a aplicação de biocidas naturais. Ciência e Tecnologia, Jaboticabal, v.2, n.1, p. 27-37, 2011.

VOLKART,P,A.;SPAGIARI,S,M.;BIZZANI,B.Avaliação da susceptibilidade e resistência bacteriana aos agentes controladores do crescimento de uso hospitalar e industrial.Arq.Cienc. p.1-8,2012.Universidade Católica do Rio Grande do Sul, PUCRS, 2012.

CUNHA,F,A. A utilização e o manejo adequado de leveduras traz ganhos para a produção de etanol. Revista RPAnews cana e indústria, n. 196, p. 30-32, 2017.

MORATO, F. Avaliação da atividade microbactericida de desinfetantes químicos utilizando a técnica de cultivo em camada de ágar Middlebrook7H11, Dissertação de Mestrado, Universidade de São Paulo.2007.

Taylor,J,H,;Rogers,S.J;Holah.J.T.; A comparison of the bactericidal efficacy of 18 disinfectants used in the food industry against Escherichia coli O157:H7

and Pseudomonas aeruginosa at 10 and 20 °C, Journal of Applied Microbiology, v.87, p. 18-732, 1999

MÜCKE, N.; Sensibilidade celular e de biofilme de Enterococcus sp. aos desinfetantes de uso industrial, Dissertação de Mestrado, Universidade Tecnológica Federal do Paraná (UTFPR).2016.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria n° 101, de 17 de agosto de 1993. Dispõe sobre os Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos. 1993. Disponível em:<http:// http://www.crmvgo.org.br/legislacao.pdf>. Acesso em 22 nov.2018.

BRASIL. Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento, Portaria Ministerial nº 574, de 8 de dezembro de 1998. Dispõe sobre os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Disponível em:<http:// www.defesa.agricultura.sp.gov.br/legislacoes/instrucao-normativa-sda-62-de-26-08-2003>. Acesso em 22 nov.2018.

Sobre Angélica Firmino

Nome: Angelica Firmino dos Santos.
Graduação em Biologia
Especialização em Biotecnologia.
Atualmente microbiologista da Usina Califórnia de Parapuã/SP interior.

Orientadora: Andreia de Menezes Olivo.

Assuntos

Eficiência e sensibilidade de bactericidas industriais aplicados no processamento de cana

Artigo de Angélica Firmino

Conclusão

Sobre Angélica Firmino